dna体外扩增技术总结|dna扩增

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目的基因的获取及体外扩增技术概述

在基因的研究及体外人工复制过程中，我们通常把需要研究的基因称为目的基因。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达，常用的方法有PCR法、cDNA法及建立基因文库等。

1.PCR法技术及原理

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。它是一种体外酶促合成，扩增特定 DNA片段的方法。1985年由美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。

PCR技术模拟DNA的天然复制过程，基于DNA的半保留复制原理，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程：变性——退火——延伸。变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热至93℃左右，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。范文写作退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性——退火——延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一次循环需2～3min，2～3h就能将目的基因扩增、放大几百万倍。一般单一拷贝的基因循环25～3O次，DNA可扩增 100万～200万倍。

由于该技术具有较强的灵敏度，由于产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。同时对标本的纯度要求低，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织

等DNA扩增检测。加之准确度和特异性，又能快速简便进行检测，因而其应用领域也在不断延伸。但由于其复制必须有引物做模板，故只能用于复制扩增及检测已有的DNA片段，使用上具有一定的局限性。

2.cDNA文库法

cDNA为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA）不同而无内含子；范文TOP100相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。

由于真核生物基因组DNA非常庞大，而且含有大量的重复序列，很难直接分离得到靶基因片段，而cDNA则来自反转录的RNA，不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离得到相关基因。同时由于RNA分子敏感脆弱，自然状态下难以被扩增，因此为了研究mRNA所包含的信息，一般将其反转录为稳定的双螺旋DNA分子（即cDNA）在插到自我复制的载体中即可。

此过程包含5个阶段：

（1）总RNA的提取。细胞中总RNA包含mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA），一个典型的动物细胞总RNA含量中，rRNA占80%～85%，tRNA和sRNA约占15%～20%，而mRNA只占1%～5%。同时由于mRNA为单链，容易受核酸酶攻击被破坏，因此要保证环境和实验器皿没有被RNA酶污染。从而保证被提取物良好的存活率。思想汇报专题总RNA抽提方法有很多种，目前实验室常用的方法是用异硫氰酸胍—苯酚抽提法，使用Trizol试剂进行。除此之外还有硅胶模纯化柱法等。

（2）mRNA的纯化。真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端的帽子结构和3’端的polyA尾巴，此结构为真核生物mRNA的提取提供了极为方便的选择性标志。试验中常用寡聚纤维素色谱柱法获得高纯度的mRNA，在高盐缓冲液下，mRNA被特异性结合到色谱柱上，再用低盐或蒸馏水洗脱，经两次色谱柱纯化后即可得高浓度mRNA。目前许多商业试剂盒也可以用作mRNA的纯化，并且有相当好的效果。操作简便，快捷

且灵敏度较高。

（3）cDNA的合成。cDNA的合成包括第一链和第二链的合成。第一链是一mRNA为

模版，在反转录酶的作用下反转录成cDNA.该酶和成DNA时需要引物引导，常用的引物为oligodT。第二链cDNA的合成是以第一链为模板，以DNA聚合酶催化。

（4）cDNA文库的构建。由于cDNA的长度一般在0.5～8kb，常用噬菌体类载体和

质粒做载体，将 cDNA 重组到载体上。合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：

① 借助于末端转移酶的 3" -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3" -OH 端分别加上均聚核苷酸链；

② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，最全面的范文参考写作网站然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体；

③ 通过粘性末端连接。

然后重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。

当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。

（5）基因文库的筛选。基因文库的筛选是指通过某种特殊的方法从基因文库中鉴

定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程。用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有核酸杂交，免疫学杂交检测，cDNA同胞选择，PCR筛选法等。

3.化学合成法

自然界中有些组织特异性mRNA含量很低，很难用cDNA法克隆;同时有些基因比较短，如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等，采用基因文库方法合成过程比较复杂而且时间成本比较高，相比采用化学的方法合成成本更低，这就需要我们采用化学的方法对其进行合成。

化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。同时DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5"→3"方向延伸，而是由3"端开始，其合成法的前提必须是已知目的基因的DNA序列，一般情况下化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。

从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。目前，一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。

其合成方式根据所合成DNA片段的大小一般分成三种：

（1） 小片段粘接法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段。片断之间有互补区，混

合退火形成有断点的双链，再由T4 DNA ligase连接成完整双链。

（2） 补钉延长法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段及20-30bp的单链DNA中片

段。片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶

延伸成完整双链。

（3） 大片段酶促法：分别合成40-50bp的单链DNA大片段。片断之间有局部互补区，

可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。

三种方法各有利弊：小片段粘接法中化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高；但化学合成的份额较大，成本较高，由于大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅7.7%。故一般采用大片段酶促法，其化学合成的份额较小，成本较低；

随着生命科学和分子生物学等相关基础学科的发展，分子生物相关领域也在不断创新。生物基因工程，杂交育种，DNA检测等一系列技术也越来越多的应用到了我们的生活中，包括工业，农业，畜牧医疗等行业，而目的基因的获取作为这些工作的第一步，尤其显得重要。近年来，越来越多的基因技术被用在医疗诊断，药物研发治疗领域，尤其癌症，艾滋等一系列恶性疾病的诊断与治疗中，相信随着分子生物这一学科领域的持续发展，这些恶性疾病被攻克为期不远。

参考文献：

［1］ 李莹.DNA体外扩增技术—聚合酶链式反应(PCR)［Ｊ］-沈阳师范学院学报（自然科学版)．2000,18(4) ［2］邓小红，任海芳.PCR技术详解及分析［Ｊ］-重庆工商大学学报（自然科学版）.2007,24(1) ［3］郑景生，吕蓓.分子植物育种［Ｊ］-分子植物育种.2003,1(3)

［4］朱玉贤，李毅，郑晓峰.现代分子生物学（第3版）.北京:高等教育出版社，2007：167～176

［5］毛新国，景蕊莲，孔秀英，赵光耀，贾继增.几种全长cDNA文库构建方法比较［Ｊ］-遗传.2006,28(7) ［6］李鹏，刘文忠，栗艳.三种获取目的基因的PCR方法［Ｊ］-乳业科学与技术.2008,(4) : 195～198 ［7］ 张京生，董自政.化学合成DNA片段的鉴定及纯化［Ｊ］-军事医学科学院院刊.1990,(04)

［8］段海燕，章锦才，黄萍，张蕴惠.四种方法获取DNA 用于检测IL-1 基因多态性的比较分析［Ｊ］-

华西口腔医学杂志.2001,19(1)

［9］孙春晓，于常海.基因克隆的常用方法介绍［Ｊ］-生理科学进展.2000,31(1)

篇二：核酸体外扩增技术

创新助手报告

——主题分析报告

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北京万方软件股份有限公司

2014-06-27

报告目录

报告核心要素.........................................................................................................I

一、主题简介........................................................................................................1

二、主题相关科研产出总体分析........................................................................1

2.1 文献总体产出统计................................................................................1

2.2 学术关注趋势分析................................................................................2

三、主题相关科技论文产出分析........................................................................2

3.1 中文期刊论文........................................................................................2

3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表.................................................2

3.1.2 中文期刊论文增长趋势.............................................................3

3.1.3 发文较多期刊.............................................................................4

3.1.4 发文较多的机构.........................................................................4

3.1.5 发文较多的人物.........................................................................5

3.1.6 核心期刊分布数量对比.............................................................5

3.1.7最近相关中文期刊论文..............................................................6

3.1.8被引较多的相关期刊论文..........................................................7

3.2 学位论文................................................................................................8

3.2.1 近十年学位论文年代分布列表.................................................8

3.2.2 学位论文增长趋势.....................................................................9

3.2.3 硕博学位论文数量对比...........................................................10

3.2.4 发文较多的机构.......................................................................10

3.2.5 发文较多的人物.......................................................................10

3.2.6 最近相关学位论文...................................................................10

3.3 中文会议论文......................................................................................10

3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表.......................................10

3.3.2 中文会议论文增长趋势...........................................................11

3.3.3 中文会议论文主办单位分布...................................................12

3.3.4 发文较多的机构.......................................................................12

3.3.5发文较多的人物........................................................................12

3.3.6最近相关中文会议论文............................................................12

3.4 外文期刊论文......................................................................................12

3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表.......................................12

3.4.2 外文期刊论文增长趋势...........................................................13

3.4.3 最近相关外文期刊论文...........................................................13

3.5 外文会议论文.......................................................................................13 I

篇三：核酸体外扩增技术综述

核酸体外扩增技术研究进展

摘要 体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。

关键词 核酸体外扩增 聚合酶链式反应（PCR） 等温扩增

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之

一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现[1]。

一、聚合酶链式反应(PCR)

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面[2]。

聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)

和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。

二、核酸等温扩增技术

等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中[3]。

1、

链替代扩增，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在切口处向3’延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下进行扩增。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。SDA的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成。

2、滚环扩增技术

滚环核酸扩增（rolling circleamolification，RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。指数RCA原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间

内，产物呈指数递增。

3、依赖解旋酶DNA扩增

依赖解旋酶DNA等温扩增技术是美国NEB公司于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。

4、依赖核酸序列扩增

依赖核酸序列扩增技术是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程[4]。

5、环介导等温扩增

环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成[5-6]。

6、单引物等温扩增技术

单引物等温扩增技术的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由由3’端DNA部分和5’端RNA部分组成。切割酶作用后暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。

7、快速等温检测放大技术

快速等温检测放大技术最早由中科院研究人员于2005年发明。技术的核心是在待检测样品的核酸中加入含有切刻内切酶识别位点的单链检测探针及切刻内切酶，检测探针与目标基因序列杂交后形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在检测探针链切割，形成两小片段，小片段从目标序列脱落，另一DNA探针再与目标序列结合产生小片段，如此循环可得。

8、Qβ复制技术

Kacian等于1972年首次报道了Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板自我复制的功能。Qβ复制酶是Qβ噬菌体产生的一种依赖于RNA的RNA聚合酶，以单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA，也可以指数式扩增重组DNA分子。

三、展望

核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段。随着科学的发展和研究目的不同，出现了越来越多的核酸分子体外扩增技术。目前，基于PCR技术的检测方法是转基因检测的常规方法。尽管传统PCR有着各种各样的优点，但在应用方面，还有其自身的缺点。例如，循环中需要高精度的温度循环，扩增抑制剂对灵敏度的影响等，这些在转基因检测的应用中都是至关重要的。等温扩增技术不需要高精度的热循环仪，非常适应于现场检测。其他可选择的核酸扩增方法在某些方面也弥补了传统PCR技术的不足。

参考文献

[1] 陈庆山，刘春燕，刘迎雪，等．核酸体外扩增技术[J]．中国生物工程杂志，2004，24(5)：10~13

[2] 吕蓓，程海荣，严庆丰，等．体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

[J]．中国生物工程杂志，2011，31(3)：91~96

[3] 马丽敏，卢亦愚．核酸等温扩增技术研究进展[J]．浙江预防医学，2013，25(1)：24~27

[4] 高闪电，常惠芸，丛国正，等．NASBA（依赖核酸序列的扩增）技术及其在病毒检测中的应用[J]．中国生物工程杂志，2009，29(1)：80~85

[5] 黄火清，郁昂．环介导等温扩增技术的研究进展[J]．生物技术，2012，22(3)：90~93

[6] 张建中，官小燕，张海波，等．可用于转基因产品检测中的核酸体外等温扩增技术分析[J]．中国农业科技导报，2010，12(4)：29~33

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